分步转染，先电转GFP-mRNA，表达很好，然后第二天电转了一个红色荧光DNA质粒，第三天观察的时候只看到了少数细胞有红色荧光，看不到绿色荧光了，这是怎么回事呀？按说GFP已经表达了，怎么还能消失了呢

根据你的描述，GFP在第一天有很好的表达，但在第二天转染DNA质粒后，第三天绿色荧光消失，只有少数细胞有红色荧光。这可能涉及到几个不同的因素：

1. DNA质粒表达对GFP表达的抑制

• 高浓度DNA引起的翻译抑制：你已经电转过mRNA，然后再转DNA质粒，这可能引发细胞对大分子DNA的免疫反应，比如激活干扰素反应。这可能抑制了翻译，不仅影响红色荧光蛋白（DNA质粒编码的），也影响了GFP的表达。由于GFP在之前已经表达过，并不依赖DNA质粒的转染，所以会受细胞整体免疫反应的影响而丧失。

• 转染后蛋白降解：有时候当细胞在转染DNA后，可能会触发蛋白降解机制（比如E3泛素连接酶系统）。当细胞压力增加，可能会加速GFP等蛋白的降解，尤其是如果GFP蛋白表达过高或者转染效率过高的情况下。

2. GFP与红色荧光蛋白的竞争

• 荧光信号叠加效应：如果你用的是较强的质粒载体，这可能导致过度的转染荷载。红色荧光蛋白的表达可能通过直接或间接方式影响GFP的稳定性或分布。比如，红色荧光蛋白的过表达可能与细胞的内环境（比如核糖体负载、翻译腔体积、ATP消耗等）产生竞争关系，导致GFP信号减弱。

• 细胞的空间/代谢压力：过多的表达载体可能增加细胞的代谢负担，尤其在质粒DNA大量表达的情况下，细胞会优先消耗能量和资源来合成新蛋白。这可能抑制了GFP的翻译和/或稳定性，导致你观察到绿色荧光消失。

3. 细胞周期与转染效率差异

• 细胞周期与转染的时机问题：如果DNA质粒的转染没有同步到GFP转染的细胞群体，可能存在部分细胞在不同的细胞周期阶段（如G0期、S期、G2期等），而不同的细胞周期阶段对转染和蛋白表达的能力差异较大。也就是说，你的GFP在转染后几小时表达可能会被某些细胞周期阶段的不利条件影响，导致最终GFP荧光减弱。

• DNA质粒的转染效率：DNA质粒的转染效率可能并不完全和mRNA一样高，尤其是大分子DNA的转染可能受到更多的限制。那些未转染DNA质粒的细胞可能依然有较高的GFP表达，而DNA转染高效的细胞却可能因为受到免疫反应或其他因素的干扰导致GFP丢失。

4. 共转影响转染和表达的时间窗口

• 不同时间窗口的蛋白降解和稳定性：你的实验设计是先转mRNA后转DNA，这也可能导致蛋白质稳定性窗口的不匹配。GFP本来是迅速表达的，但是因为第二天的DNA质粒加入，可能影响了mRNA转运、翻译等过程，导致GFP在细胞中的半衰期变短，表达量迅速降低。而红色荧光蛋白表达量增加，可能表明细胞对DNA的负载有所响应，导致mRNA稳定性下降。

可能的解决方案或下一步行动：

1. 优化DNA质粒的转染量：尽量减少DNA质粒的用量，保持总负载不过重，可以降低免疫反应或翻译抑制。

2. 检查转染效率：检查红色荧光蛋白（DNA质粒编码的）的表达效率，看看是否是转染效率本身的问题。

3. 用不同的共转染策略：尝试通过分步转染（一天只电转DNA或RNA），并严格控制DNA和mRNA的负载量。

4. 检查GFP蛋白的稳定性：试着在转染前后用蛋白质抑制剂（如MG132）观察GFP表达的变化，确认是否是蛋白质降解导致的信号丢失。

5. 分析免疫反应：如果可行，检测干扰素反应、cGAS–STING通路的激活，看看是否是免疫反应影响了GFP表达。

总之，第二天电转DNA质粒可能在短期内引发了细胞的免疫反应或资源竞争，影响了GFP的稳定性或翻译效率。建议可以先尝试降低DNA质粒的量，并结合上述优化方案逐步调试。