siRNA转染后目标基因不降反升的原因

一、生物学与分子机制相关原因

1️⃣ 负反馈调控 (feedback regulation)

• 某些基因被抑制后，会触发细胞的代偿机制。

• 例如，目标基因下调后，上游转录因子或信号通路被激活，从而 反向上调目标基因 的转录。

• 特别常见于信号通路核心分子（如 MAPK、PI3K、NF-κB、p53 等）的 knockdown 实验。

建议：检测上游调控蛋白或信号分子是否被激活。

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2️⃣ 非特异性反应 / 免疫反应激活

• siRNA 可能诱导 干扰素反应 或 炎症通路激活（如 STAT1、OAS、PKR 上调）。

• 这种反应会导致大量基因表达异常，包括目标基因。

• 一些基因启动子含干扰素响应元件（ISRE），会被误激活。

建议：

• 检查 IFNβ、OAS1、STAT1、ISG15 等干扰素相关基因是否上调；

• 换用化学修饰的 siRNA（如 2′-O-methyl 修饰）可减轻免疫反应。

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3️⃣ siRNA 设计不当（脱靶效应 / seed effect）

• siRNA seed 区（2–8位）可能与非靶基因3’UTR 匹配，引起脱靶调控；

• 若该非靶基因反过来调控目标基因上调，则出现“目标基因假性上调”现象；

• 也可能 siRNA 对目标基因的某个转录本降解，而该降解刺激了另一个 isoform 的补偿性转录。

建议：

• 使用不同序列的 siRNA 验证（至少 2–3 条）；

• 检查目标基因不同转录本表达情况；

• 用 siRNA off-target 预测工具（如 siSPOTR、RNAxs、BLOCK-iT Designer）复核设计。

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二、实验操作或技术性原因

4️⃣ 转染效率不均 / 细胞状态差

• 转染效率太低，只有部分细胞受到影响；

• 或细胞应激（如饥饿、污染、过度汇合）导致基因表达异常。

• siRNA本身或转染试剂（尤其是阳离子脂质体）可引发细胞应激，改变转录谱。

建议：

• 检查转染效率（如使用FAM标记的siRNA）；

• 使用健康、低传代的细胞；

• 设置“转染试剂空白组”对照。

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5️⃣ 检测时间点选择不当

• siRNA 抑制作用通常在 24–72 小时最明显；

• 若时间过晚，mRNA 可能已恢复或被反向诱导；

• 某些基因在 knockdown 后被细胞反馈性上调。

建议：

• 设定多时间点（24h、48h、72h、96h）检测 mRNA 和蛋白。

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6️⃣ mRNA 与蛋白检测不一致

• 可能 mRNA 被降解，但蛋白因半衰期长仍未下降；

• 或反之，mRNA检测升高但蛋白被抑制；

• 说明仅检测 qPCR 结果并不能代表功能 knockdown。

建议：

• 同时检测 mRNA 和蛋白水平；

• 必要时检测功能指标（如酶活性、表型变化）。

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三、排查与改进思路