请问嘌呤霉素的持续筛选需要每天更换含嘌呤霉素的培养基吗？还是筛选的时候加一次就行？

非常专业的问题！我来详细解答一下 嘌呤霉素筛选（puromycin selection） 的正确操作流程和原理，帮助你获得高效、稳定的筛选结果。

---

嘌呤霉素持续筛选时：培养基更换原则

嘌呤霉素筛选是为了筛出成功整合（或表达）抗性基因的细胞，通常建议：

每天或隔天更换含嘌呤霉素的新鲜培养基。

原因：

• 嘌呤霉素在培养基中会逐渐失效（降解或被细胞吸收），尤其在高细胞密度或长时间培养时，抗生素浓度会下降。

• 死亡的敏感细胞会释放代谢产物，污染培养基，影响筛选效果。

• 保持嘌呤霉素的稳定浓度，有助于彻底杀死未转染或未整合的细胞，避免假阳性克隆存活。

不建议只加一次就不换液：

• 这样容易出现漏筛现象，敏感细胞可能因抗生素浓度不足而存活。

• 培养基污染、pH 改变等也会影响细胞状态。

---

嘌呤霉素筛选常规操作时间

• 按预实验确定的有效浓度开始加药（比如 1-10 μg/mL，视细胞系而定）。

• 第 1 天加药后，每天或隔天换一次新鲜含嘌呤霉素的完全培养基。

• 一般 3-7 天左右敏感细胞全部死亡，剩余细胞即为稳定表达抗性基因的群体。

• 后续可以逐渐降低换液频率（如每 2-3 天换液一次），维持低剂量筛选浓度，防止假阳性污染。

---

筛选小贴士

做前期杀死曲线（kill curve），确定不同浓度下敏感细胞死亡时间。
每次换液都保留含药物的培养基浓度一致，不要漏加药物。
如果使用嘌呤霉素冻存细胞，复苏后需要重新用低浓度维持筛选。

---

总结

筛选时不是加一次就够，要每天或隔天换新鲜含药培养基，以确保筛选压力稳定有效。
后期可逐渐延长换液间隔，但始终维持嘌呤霉素浓度。