请问瞬时转染的效率如何确定？荧光镜下看感觉无法量化和保证每个组别的转染效率完全一致

这是一个很重要也很实际的问题——瞬时转染效率是RNA干扰或质粒表达实验中一个关键变量，但很多人低估了它对结果的影响。

问题核心：

你说得非常对：

“荧光镜下看感觉无法量化和保证每个组别的转染效率完全一致。”

用荧光镜看确实是定性评估，不够准确，且不同组别（尤其不同处理条件）可能转染效率不同，导致后续敲低效率、蛋白表达等结果不具可比性。

几种常见的转染效率评估与控制方法：

1.流式细胞术（Flow cytometry） — 金标准

将带有荧光标签（如GFP）的质粒/siRNA与目标序列共同转染；

24-48小时后用流式测定荧光阳性细胞比例；

能准确量化转染效率，如：“转染效率为72%”。

优点：高精度、可以与蛋白表达（双染）同时测
缺点：需要流式平台，不是每个实验室都有

2.共转染荧光报告质粒

和你的siRNA或目标质粒一起共转一个GFP表达质粒（如pEGFP-N1）；

然后用荧光显微镜+ImageJ分析荧光图像（手动数细胞）；

粗略估算阳性细胞比例，比如10个视野取平均。

优点：低成本、操作简单
缺点：精度较低，易受主观影响

3.qPCR 检测转染 marker mRNA 水平

如果是siRNA实验，有时会加入一个对照siRNA（比如靶向非哺乳动物基因如 luciferase）；

可以检测marker mRNA的降低幅度间接反映转染效果。

4.Western blot 目标蛋白量下降情况（配对对照组）

如果你没有办法直接测效率，可以用目标蛋白在多个时间点的表达变化来反推；

并确保每个实验重复中加入内参（如β-actin）以比较一致性。

如何尽可能保证各组一致的转染效率？

细胞密度统一（最重要）：细胞密度影响转染效率，一定要分装均匀（比如6孔板种每孔3×10⁵）；

试剂比例固定：每组 siRNA / DNA、转染试剂的用量必须严格一致；

混合方式统一：比如转染混合物孵育时间、加到细胞前的混匀方式都应一致；

对照组并行操作：做 knockdown、negative control、mock 组时，操作尽量同步进行；

设置转染效率内控：如共转GFP，帮助判断每组是否有偏差。

总结：

方法 是否量化 精度 建议使用情况
流式细胞术 是 ⭐⭐⭐⭐ 有设备时首选
共转GFP+ImageJ计数 部分可量化 ⭐⭐ 粗略比较
qPCR检测阳性marker 间接量化 ⭐⭐ RNA类实验可考虑
Western反推效率 否 ⭐⭐ 仅供参考