2024年 7月 15日, 星期一
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蛋白质的长期保存——以冻结溶液的形式保存

可溶性蛋白质制备物的冷冻是最常用的保存方法之一。将一支装有蛋白质溶液的试管放入机械冰柜中既简单又方便,在低温中,化学降解的速度通常降低,而且如果冷冻本身不引起蛋白质变性,样品应当稳定几周至几个月,特别是将蛋白质样品保存在-80°C 或更低的温度中。然而,冷冻能够引起蛋白质变性,这是因为一些应激而造成的,这些应激包括:低温、溶质的浓度、冰-液体界面的形成和潜在的pH 剧烈下降。在溶液中加入冷冻保护剂能够减少这种降解的风险,非特异性冷冻保护的机制与添加剂增加在水溶液中的热力学稳定性的机制相同(Heller et al. 1996) ,而且在两种情况下同一种化合物都有效。良好的蛋白质冷冻保护剂的例子包括:甘油、盐析盐和二糖。对剧烈的冻融应激的保护程度通常与溶质的起始浓度成正比,要得到最佳保护,通常需要浓度高于0. 3 mol/L。

在冻融过程中,另一类能够提供保护的化合物是表面活性剂,如聚山梨醇酯和聚乙二醇,通常在低至0.1% (m/V) 的浓度就能够得到最佳的效果。认为表面活性剂通过与蛋白质分子竞争冰-液体界面来抑制蛋白质变性(Chang et al. 1996) 。

其他蛋白质(如BSA) 和合成的聚合物也能够抑制冷冻引起的蛋白质去折叠,所需浓度相对较低(约为百分之几)。尽管这些化合物被优先地从蛋白质的表面排阻,但是,其摩尔浓度并不足以高至能够通过这种机制来明显地改变蛋白质的化学势能,相反,在冷冻期间,聚合物似乎是通过在空间上影响去折叠(由于大分子拥挤)来抑制蛋白质变性的。通过增加蛋白质的起始浓度,能够增强在冻融过程中蛋白质制备物对损伤的耐受性。如果在一个给定的冻融样品中。所见到的蛋白质损伤是由于蛋白质吸附到引起变性的冰-液体界面而引起的,那么这种损伤对于一个给定的样品体积是一定的。这样,当蛋白质的起始浓度增高时,变性蛋白质分子的百分比就会下降。而且,上面讨论的通过排阻体积效应的保护也可以用于同一种蛋白质溶液的单个蛋白质分子上。

要测定一个给定的溶液是否适合于冷冻保存,可以先冷冻一些小份,然后在次日融化。通常情况下,如果蛋白质能够耐受剧烈的冻融应激,那么当在同一种溶液中冷冻时,它就具有相对好的保存稳定性。对于- 80°C 和-20°C 保存,应当首选 – 80℃。第一,较低的温度可以较大程度地减慢降解反应;第二,在很多地方,冰箱冷冻室内通常达不到-20℃, 特别是靠近门的地方,而且在无霜冰箱中,样品会经过反复的冻融;最后, -20°C 接近某些盐的共融点温度,温度在这个温度上下循环能够引起共融晶体的溶化和重新形成,从而会引起蛋白质变性。

反复冻融能够逐渐地增加样品的蛋白质变性,应当避免。相反,应当将蛋白质溶液分成许多小份,可根据需要取出小份、融化,然后使用。

研究人员在冷冻保存蛋白质时最常犯的错误是使用磷酸钠缓冲液。在冷冻的过程中,二碱基的盐结晶,而酸性盐仍然保待可溶。这样,在冷冻溶液中,磷酸钠的pH 会下降很多(如pH 4) ,这会引起许多的蛋白质变性(如Anchordoquy and Carpenter 1996) 。在冷冻期间pH 不太可能发生改变的缓冲液有柠檬酸盐、Tris 和组氨酸。

 

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