2024年 7月 20日, 星期六
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蛋白质的长期保存——以冻干固体的形式保存

一种按适当配方制造的冻干蛋白质制剂能够在几年内保持稳定,即使是在室温(Carpenter and Chang 1996) ;然而,冻干配方的最佳溶液组成和工艺条件的研制远远超出了典型学术实验室的能力范围。一个主要的困难是大多数实验室中所用的冻干机通常没有控制样品温度的能力,不能达到低水平的残留水(如低于质量的1%~2%),而低水平的残留水是冻干产品长期保存活性所需要的。要有效地干燥样品,在冻干过程的最后阶段,其温度必须升至高于室温,而且,在干燥过程中如果没有温度控制,样品会坍塌成块,使其更难除去水分。

对于某种给定的冻干机,即使能够研制出合适的工艺条件,使用正确的添加剂也是至关重要的,以防止在冻干和干燥期间蛋白质的变性(综述见Carpenter and Chang 1996; Carpenter et al. 1997) 。在这些应激期间和在以冻干固体的形式保存期间,二糖蔗糖和海藻糖对于蛋白质的保护很有效。这些糖是非还原性的,不应当使用还原性糖(如葡萄糖和麦芽糖),因为其会通过美拉德反应(Maillard reaction) 降解蛋白质。

在冷冻期间,保护的程度取决于起始的总糖浓度,而在干燥期间,保护的程度取决于糖:蛋白质的质量比率(Carpenter and Chang 1996) 。如上所述,冷冻保护是由于从蛋白质表面的优先排阻,这样便增加了去折叠的自由能,在干燥期间,随着与蛋白质分子表面发生水合作用的水被除去,蛋白质分子去折叠,糖能够通过在冻干蛋白质的失水位置结合氢来防止这种破坏。

冻干制剂的保存稳定性取决于低残留水含量(如低于质量的1%~2%)、在冷冻和干燥期间天然蛋白质构象的保留(可用保护性添加剂来实现)和样品保存[低于非结晶相(含有蛋白质和稳定性糖)的玻璃跃迁温度] ( Carpenter and Chang 1996) 。测量这些物理参数通常超出了大多数学术实验室的能力。

这样,对于大多数实验室,只有在发现所有其他增强保存稳定性的方法都不适合时才应当考虑冻干。如果必须使用非最佳的工艺(即没有办法控制冻干机中的样品温度),而且也不能够测量重要的物理参数,那么还有机会得到一种稳定的冻干制剂吗?答案是“可能“。实际的方法是制备浓度相对高的蛋白质(能够增加对冷冻的耐受性,并减少要干燥的体积),使用足够的海藻糖或蔗糖来抑制在冷冻和干燥中的去折叠。如果蛋白质制剂能够耐受冷冻,糖:蛋白质的质量比率在1~2 通常就能有效地防止在干燥过程中蛋白质的去折叠。在冷冻期间,如果需要保护,糖的起始浓度通常需要达到200~300 mmol/L才能得到最佳保护。

加入一种碳水化合物聚合物(如葡聚糖、聚蔗糖、羟乙基淀粉)可能也会有益处,这种聚合物能够提供样品体积并增加非结晶相的玻璃跃迁温度。有时需要加入增量剂来防止在干燥期间蛋白质从容器中逸出,而且,这些聚合的非结晶的增量剂使得样品的干燥更容易,并且不发生坍塌。2%~3% (m/V) 的聚合物起始浓度通常能够提供适当的膨胀(bulking) 。

样品冷冻通常采用以下两种方法:将其放入机械冰柜中或将样品容器浸入液氮中。最好将制剂分到几支小试管(如1. 5 ml 聚丙烯微量离心管)中,不要在少量的容器内冻干相对大体积的样品。

冷冻样品应当放在一个容器中(如干燥器或烧瓶),将容器连接到冻干机上,并立即开始抽真空。在工艺的第一阶段(除去冰),升华冷却应当保持样品冷冻,当除去冰以后,样品温度将升至室温。在这一段时间内,从剩余的非冰相中除去部分的水,样品应当在真空下保持足够的时间,以“完成“干燥过程。实际上干燥永远不会完成。更正确地说是水含量最后达到一个最低的水平,在此之后,在室温和真空条件下,再延长时间也不会进一步干燥。在室温干燥以后,在蔗糖或海藻糖配方中残留的水含量通常高于质量的4%~5% ,必须靠经验来确定所需要的实际干燥时间,但是,如果没有所需的测试设备,这可能会成为一个问题。为了安全起见,例如,对于一个体积为 0.5 ml 的典型样品,建议将样品在真空下保持至少1 ~3 天,而且,为了尽可能地减少蛋白质的降解,建议将冻干样品 -20℃ 保存,在- 80°C保存更好。与简单的冷冻溶液相比,所有这些努力似乎是多余的,特别是当对于非最佳状态下冻干的样品可能还需要在零下温度保存时。

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