2022年 1月 28日, 星期五
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RNA 定量-紫外(UV) 分光光度法

在进行大多数RNA 分析之前, RNA 定量是一种重要和必需的步骤。RNA 定量方法可以分为两类:紫外(UV) 分光光度法,此方法基于嘌呤和嘧啶碱基的吸收光谱; 基于荧光染料的方法,结合到核酸时选择性发荧光,测定荧光染料的强度。如果RNA 样品是纯的( 如没有诸如蛋白质、酚、琼脂糖或其他核酸的污染),用UV 分光光度法测量被碱基吸收的UV 射线简单而且精确。然而,如果样品中含有较多的杂质,或者如果RNA 的浓度非常低,最好使用荧光染料为基础的方法。有关分光光度法与荧光染料为基础的方法概述如表1

紫外吸收分光光度法

常规分光光度法

用于测定纯化的RNA 样品中的RNA 浓度,最常用的方法是在260nm 处测量其相对一个空白样品的吸光度(A260) ,即用于溶解RNA 的相同溶剂。A260 为1.0 对应40μg/mL 的单链RNA 。计算溶液中RNA浓度的公式如下:

RNA 样品浓度(μg/mL) =A260 X 40 X 稀释倍数

这种方法需要的设备很少,通常包括:配备紫外灯的分光光度计和石英比色皿或特殊的能透射紫外线的塑料比色皿(测量核酸的吸光度所需的短波长被玻璃和一些塑料比色皿吸收) 。因为它快速简便、无损样品,所以吸收光谱法早已被用于测量纯的浓缩液中RNA的含量。该方法的准确度取决于几个因素。

  • RNA 溶液的浓度。吸收光谱法的局限性之一是它相对不敏感,因此对大多数实验室的分光光度计,核酸浓度至少为4μglmL 才能获得可靠的A260 。另外, RNA 溶液的浓度必须在分光光度计的线性范围内;通常情况下, A260 值应落在0.1 ~ 1.0 之间,此范围以外不能进行精确测量。如果溶液的A260 为1.0, 应稀释5 ~ 10 倍。如果溶液的A260为0.1, 应选用更精确的测定小量RNA 浓度的方法。

    表1 概述分光光度法与荧光染料为基础的方法

    定量方法 范围(未稀释) 用量 设备 优点 缺点 安全性
    紫外吸收分光光度法            
    传统分光度法 4~ 40μg)mL 1 – 200μL N/A 不破坏样品
    常规设备即可
    用量大; 灵敏度
    低;仅精确定量纯RNA 样品
    N/A
    微量分光光度法 2~3000μg/mL 0.5- 2.0μL N/A 分析小量样品:高敏感性;样品可回收 需要昂贵设备 N/A
    荧光染料为基础的方法            
    EB >200 n g/mL N/A UV 透射器 便宜 破坏样品,灵敏度低 可能诱发突变
    RiboGreen 1 ng/mL- 1μg/mL N/A 荧光计 高敏感性: 广谱线性范围 不能区分RNA与DNA 比EB 安全
    SYBR Green Ⅱ 2ng/mL~ 2μg/mL N/A 荧光计 高敏感性 不能区分RNA 与DNA 比EB 安全
    Quant-iT RNA Assay 250pg/μL~l00ng/μL N/A 荧光计 在含DNA 时可定量RNA   未知
  • RNA 样品的纯度。A260 不能区分RNA 和DNA, 因此,建议用无RNase 的DNase处理RNA 样品去除DNA 污染。此外,污染物如苯酚和蛋白质会影响A260 的读数;苯酚在波长为260nm 处有强烈的吸收,而芳香族氨基酸的吸收在280nm处。在260nm 处吸光度相对于280nm 的吸光度比值(A260/A280) 可以用来评估RNA样品中蛋白质的污染水平。纯的RNA 的A260/A280 值接近2.0 。如果有明显的蛋白质或酚污染, A260/A280 比小于2 . 0, 用紫外分光光度法将不可能准确定量核酸含量。另一个比值A260/A230 可用于评估有机化合物或高离液盐( chaotropic salt) 的污染水平,它们在波长230nm处有强烈吸收,导致低A260/A230 。理想情况下,提取RNA的A260/A230 的比例应接近2.0 。
  • pH 和离子强度。A260/A280 比值依赖于pH 和离子强度。随着pH 的增加, A280 降低,但A260 不受影响,从而A260/A280 的比值增加。因为纯水( 如蒸馏水、MilliQ 或无RNase/DNase 水) pH 为酸性,如果使用它们溶解RNA, A260/A280 的比值可能偏低。因此为了准确的可重复的读数,最好使用缓冲液如TE ( pH8.0 ) 作为稀释剂和空白对照
  • 洁净的比色杯。脏的石英比色皿、粉尘颗粒,以及RNA 溶液的混浊度能造成在320nm处光的散射,都会影响A260 的读数。因为在320nm 处蛋白质和核酸不吸收,需要进行背景校正:减去以前使用的相同比色皿A320 来估计RNA 的吸光度。

微量分光光度计

除了灵敏度低,常规分光光度法的另一个局限性是其比色杯体积较大,如果想不损失一部分样品,很难对低浓度的RNA 进行定量。为了克服这些间题,后来开发出了微量分光光度法,这一方法可以高度精确并可重复地分析小体积样品( 0.5 ~ 2.0μL ) ,而且不需要比色皿、毛细管或其他样品器件。这样的仪器包括但不限于NanoDrop 分光光度计(Thermo Scientific ) 、NanoVue 分光光度计、Nano-Photometer UVNis 分光光度计( Implen ) 与Picodrop Microliter UV/Vis 分光光度计。这些仪器可以测量很大的波长范围(通常200~1 lOOnm ) ,因此可以用来测量RNA 、DNA 和蛋白质,某些清况下还可以测量染料(如花青素染料Cy3 和Cy5 标记的)。该仪器还可进行波长扫描以检测杂质;然后仪器软件将显示整个波长范围内的光谱, 计算A260 以及A260/A280 和A260/A230 的值。测量后样品可以用吸头轻松回收,或擦净样品板或清洁传感器。值得注意的是, Picodrop 可以通过吸头直接测量,从而没有污染并能完全回收样品。

这些工具中, NanoDrop 也许是最常用的。NanoDrop 分光光度计家族采用了获得专利的样品保留系统,可以分析体积小至0.5~2.0μL 的样品。使用该仪器只需直接吸取样品到光学“基座“,放下上部的“样品臂"覆盖至样品上,从而由于表面张力生成液状的"样本柱”被保待在适当位置。然后基座移动自动调整为理想的通道长度(1mm) 。之后用装在基座上的两个光纤(发射光的疝气灯)与样品臂[线性电荷耦合( CCD ) 阵列探测器的光谱仪]进行光谱测定。最早的NanoDrop 仪器——NanoDrop ND-1000 紫外/可见分光光度计的波长范围为220 ~ 750nm, 可以测定lμL 浓度为2 ~ 3000ng/mL 的样品,而不需要稀释, 这比传统分光光度计的范围约宽50 倍。新的NanoDrop 仪器提供了更大的波长范围,扩展了浓度范围与比色槽性能,可一次分析多达96 个样品。

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