2022年 8月 17日, 星期三
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ChIP超详细实验步骤

ChIP的一般流程:

甲醛处理细胞—收集细胞,超声破碎—加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合—加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀—对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合—洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物—解交联,纯化富集的DNA-片断—PCR分析。

实验步骤:

一、细胞的甲醛交联与超声破碎( 第一天)

  1. 取出1平皿细胞(10 cm平皿),加入243 μl 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9 ml)。
  2. 37℃孵育10 min。
  3. 终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 μl 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5 min即可。
  4. 吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。
  5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中(PBS依次为5 ml,3 ml和3 ml)。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
  6. 倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106 个细胞。这样每100 μl溶液含1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106 个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106 个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800 ul。
  7. 超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。

二、除杂及抗体哺育 ( 第一天)

  1. 超声破碎结束后,10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。
  2. 留取300μl 做实验,其余保存于-80℃。
  3. 300 μl中,100 μl 加抗体做为实验组;100 μl 不加抗体做为对照组;100 μl 加入4 μl 5 M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M),65℃处理3 h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。
  4. 在100 μl 的超声破碎产物中,加入900 μl ChIP DilutionBuffer和20 μl的50×PIC。

再各加入60 μl ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。

  1. 1 h后,在4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min。
  2. 取上清。各留取20 μl 做为input。一管中加入1 μl 抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。

三、检验超声破碎的效果 ( 第一天)

  1. 取100 μl超声破碎后产物,加入4 μl 5M NaCl,65℃处理2 h解交联。
  2. 分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

四、免疫复合物的沉淀及清洗( 第二天)

  1. 孵育过夜后,每管中加入60 μl ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转2 h。
  2. 4℃静置10 min后,700 rpm离心1 min。除去上清。
  3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10 min,4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min,除去上清。

洗涤溶液:

(1)low salt wash buffer-one wash

(2)highsalt wash buffer-one wash

(3)LiCl wash buffer-one wash

(4)TE buffer-two wash

  1. 清洗完毕后,开始洗脱。

洗脱液的配方:100 μl 10%SDS,100 μl1M NaHCO3,800 μl ddH2O,共1 ml。

每管加入250 μl洗脱buffer,室温下颠转15 min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 μl。

  1. 解交联:每管中加入20 μl 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M)。
  2. 混匀,65℃解交联过夜。

五、DNA样品的回收(第三天)

  1. 解交联结束后,每管加入1 μl RNaseA(MBI),37℃孵育1 h。
  2. 每管加入10 μl 0.5 M EDTA,20 μl1M Tris.HCl(PH6.5),2 μl 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。
  3. DNA片段的回收。最终的样品溶于100 μl ddH2O。

六、PCR分析(第三天)

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

注意事项:

  1. 注意抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。
  2. 注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
  3. 为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

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