2022年 1月 24日, 星期一
新闻

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

一、原理

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

二、实验材料

  • 组织或细胞样品

三、试剂、试剂盒

  • RNA提取试剂
  • dNTP 混合物
  • Taq DNA聚合酶
  • 第一链cDNA合成试剂盒

四、仪器、耗材

  • 离心管
  • 离心机
  • 水浴锅
  • PCR管
  • 电泳仪
  • 凝胶图像分析系统

五、操作步骤

1.总RNA的提取:前面文章有做专门介绍,点击链接查看:Trizol法提取总RNA的流程

2.cDNA第一链的合成

  • ① 在0.5ml微量离心管中,加入总RNA 1-5μg,补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,轻轻混匀、离心。
  • ② 70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物:10×PCR buffer  2μl;25mM MgCl2  2μl;10mM dNTPmix 1μl;0.1M DTT  2μl。轻轻混匀,离心。42℃孵育2-5min。
  • ③ 加入SuperscriptⅡ1μl ,在42℃水浴中孵育50min。
  • ④ 于70℃加热15min以终止反应。
  • ⑤ 将管插入冰中,加入RNase H 1μl ,37℃孵育20min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。

3.PCR

  • ① 取0.5ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA   2μl;上游引物(10pM) 2μl;下游引物(10pM) 2μl;dNTP(2mM) 4μl;10×PCR buffer 5μl;Taq 酶(2u/μl) 1μl。
  • ② 加入适量的ddH2O,使总体积达50μl。轻轻混匀,离心。
  • ③ 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照。
  • ④ 电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。
  • ⑤ 密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。

六、注意事项

  • 在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂。
  • 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。
  • 内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
  • PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。
  • 防止DNA的污染:① 采用DNA酶处理RNA样品;② 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。

 

 

 

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