逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

一、原理

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

二、实验材料

• 组织或细胞样品

三、试剂、试剂盒

• RNA提取试剂
• dNTP 混合物
• Taq DNA聚合酶
• 第一链cDNA合成试剂盒

四、仪器、耗材

• 离心管
• 离心机
• 水浴锅
• PCR管
• 电泳仪
• 凝胶图像分析系统

五、操作步骤

1.总RNA的提取：前面文章有做专门介绍，点击链接查看：Trizol法提取总RNA的流程

2.cDNA第一链的合成：

• ① 在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H₂O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
• ② 70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：10×PCR buffer  2μl；25mM MgCl₂  2μl；10mM dNTPmix 1μl；0.1M DTT  2μl。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
• ③ 加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
• ④ 于70℃加热15min以终止反应。
• ⑤ 将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。

3．PCR：

• ① 取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA   2μl；上游引物（10pM） 2μl；下游引物（10pM） 2μl；dNTP(2mM) 4μl；10×PCR buffer 5μl；Taq 酶（2u/μl） 1μl。
• ② 加入适量的ddH₂O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
• ③ 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
• ④ 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
• ⑤ 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

六、注意事项

• 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
• 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
• 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
• PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
• 防止DNA的污染：① 采用DNA酶处理RNA样品；② 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。