2022年 1月 28日, 星期五
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电转感受态细胞的制备

1、 -80℃冰箱保存的菌种在SOB 固体平板上划单菌落;

2、次晨,挑选单克隆感至内含1ml SOB 液体培养基的试管中,37℃,300rpm,6 hr;

3、然后转接到含400ml SOB 液体培养基的2L 摇瓶中(按1:500 的量转接),300rpm,4hr,然后每隔2 min 测一次OD ,至OD =0.76;

4、立刻置冰水浴中骤冷,可以选择在一个大的装有冰水混合物的容器里快速旋转摇动内有培养物的三角瓶,尽快使培养物温度降下来;

5、随后在250ml 预冷的离心杯中离心,4℃,2000 g,10 min;

6、弃上清后,用预冷的水(灭菌的重蒸水)洗:先加少量水悬浮菌体(具体办法:在一个大的装有冰水混合物的容器里旋转摇动离心杯使菌体悬浮),菌体悬浮后再把水加满,2200 g,10 min,弃上清;

7、再用10%的甘油同样方法洗两次,2400 g,10 min;

8、最后一次倒尽甘油后(尽量去干净),用残存在管底的甘油悬浮细胞,每 120μl 分装到1.5 mL Ep 管(EP 管要-70 度预冷),用-70℃的乙醇迅速冰冻;

9、保存在-80℃冰箱中备用。

以 DH10B 为例说明:

步骤 1:每次做感受态都要新鲜划菌,不要使用保存于 4℃或室温的平板;尽量使用原代菌,最好不要用多次传代的菌;

步骤 2:该步骤与步骤 3 中出现的数字存在相关性,条件允许的话尽量按照要求做,不允许的话则按照实验室实际情况稍做修改,确保菌体生长良好;

步骤 3:确保 OD 达到要求,宁可低一点,也不要高,建议在达到 0.5 后过 2-3min 就测一次 OD 值;

步骤 4:一定要在冰水混合物中快速旋转摇动内有培养物的三角瓶,尽快使培养物温度降下来,不要静置于冰水混合物中,摇动大约 10 min;

步骤 5:建议使用离心杯,因为底是平的,灭菌时里面要装上双蒸水,利于步骤 6,7 与 8 中的悬浮操作;

步骤 6:悬浮菌体时不要使用移液枪,开始时加入的水量要少,避免过多,等菌体重悬起来以后再加满。用手摇动时保证培养基液面低于冰面,重悬过程中注意悬浮的菌团出现,需将其全部分散开;

步骤 7:同上

步骤 8:尽量倒尽甘油,使感受态更浓,每 400ml 培养物制备 1-1.5mL 感受态为宜;关于 EP 管预冷与-70℃的乙醇迅速冰冻的具体办法:在菌种保藏盒内加入适量的乙醇,再把空的 EP 管盖上帽子后放入其中,置于-70 度冰箱(或-80℃冰箱)预冷,分装感受态的时候将其取出(连带保藏盒),在超净台分装,分装时使用灭菌并剪去尖头的枪头,尽量使用 1ml 蓝色大枪头。完成后置于- 80℃冰箱;

步骤 9:关于保存感受态的温度,- 70℃、- 80℃皆可,建议实验室现有的温度最低的冰箱;

以上方法适用于很多 E.coli 菌株,例如:XL1-Blue,DH10B,DH5α,Top10,JM109,BL21 等做电转感受态,可能不同的菌株生长速度有差异,方案中的培养时间与最佳 OD 值可能有变化,不妨用此方案尝试一下,如果效率不够高的话可以对所用的菌株进一步进行优化。

注意:

1.所用的摇瓶和离心管要洗的特别干净,禁用任何洗涤剂,用 NaOH 溶液洗数次;

2.重悬菌体用手振荡,不用振荡器;

3.用枪吸打要轻,枪头需要剪去尖头;

4.如果做的效果好,效率可以达到 1010以上。

对于 E.coli 感受态制备,以上实验方案都要特别注意:所有的容器要用新的,不用洗涤剂,用手洗且保证彻底干净;相应的器材要作为制备感受态细胞专用,不做其他用途;试剂要选用最好的,尽量过滤除菌,不用高压灭菌等等。

 

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