英格恩技术博客 专注转染等实验

细胞污染的心得体会

细胞培养的质量好坏是细胞相关实验的基石,许多朋友都曾经历过因为细胞污染影响实验进度的郁闷,被老板批评是小事,要是影响到正常毕业就是大事了。怎么分辨细胞污染,是不是细胞污染?是那种细胞污染?细胞污染后如何处理?

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预防污染
细胞培养是个细致活儿,一不小心就会造成污染,最好养成良好无菌操作习惯。个人经验是,进实验室之前最好洗手,很多实验者都不bother,这是国人研究者的一种极端错误,我告诉大家,你仔细洗手比喷酒精效果还好。最好的是肥皂/香皂仔仔细细的洗手,一直到手腕,指甲缝都要洗。洗两遍是一个不错的选择。实验必备白大褂,而且一定要是长袖,袖口扎紧的那种,如果不能的话,把袖口窝向手臂。裸露的手腕部分一定也要喷酒精。最好是戴上手套后手请避免接触工作台外面,如果不得已接触,那再喷酒精。
细胞实验前,超净台/实验间紫外照射30min,细胞培养室有24h的空气消毒装置更好了。操作前70%酒精擦超净台消毒,酒精擦手,擦培养瓶,擦培养基瓶以及各种瓶子的口,总之,所有进超净台的物品最好都用酒精擦拭一遍。拿培养瓶和培养液时候尽量托下面拿,切忌不要拿瓶颈部位。有一点要注意的是,超净台里面的东西一定要尽量少放,东西太多活影响超净台内空气流通及空气除菌。实验过程中尽量避免打闹说笑。
每天观察细胞状态,一旦发现细胞不对劲(比如生长缓慢)立即进行处理。一些刚接触细胞的朋友可能有时拿不准情况,也迫切的希望得到帮助。怎么分辨细胞污染,是不是细胞污染?是那种细胞污染?细胞污染后如何处理?
细胞污染鉴别方法
这里告诉您判断污染的方法:如果是细菌污染,应该很快培基就浑浊了。如果是真菌感染,特别是初期感染,在低倍镜下可以看到小黑点,特别是成团的小黑点,要特别注意。如果无法确定,就换高倍镜,如果是死细胞,高倍镜下就可以分辨,而真菌高倍镜下仍然是小黑点。有些(比如支原体)污染,镜检是看不到的,但是细胞的生长异常。所以如果细胞生长异常,那么请扔掉,同时由于支原体空气传播,请检查自己的培养液和培养箱是不是污染。白色念珠菌是人体霉菌感染的常见霉菌种类,尽管我们有时感觉不到,但它就在你我的身边甚至身上存在着。霉菌污染多来自空气,所以做实验时说话聊天,或瓶口敞开时间太长,还有培养箱开关频繁是主要原因,应多找自身原因。培养箱水盘最好一个星期用酒精或0.2%的新吉灭擦一次,如果有紫外线照射就更好了
一旦细胞污染了,怎么解决呢?
一旦细胞污染了,怎么解决呢?当然如果你的细胞仍有富余或者冻存的,我还是建议你把污染的扔掉,再复苏方便省事。如果不幸没有,不得不把细胞救活了。对于细菌污染(常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌),可以用普通双抗(链霉素和青霉素)处理;若为霉菌或者真菌污染,加入两性霉素B清洗和培养,终浓度一般为2.5μg/ml(在30μg/ml时会有细胞毒性)。另外也可以选择在培养基里加3ug/ml的制霉菌素或放线菌素D。若为支原体或者黑胶虫污染,因为这个太难处理,处理的代价更大更麻烦,建议直接扔掉算了。以免造成实验室其他污染就得不偿失了。
对于贴壁生长的细胞,相对来说比较简单但很麻烦。以下我主要讨论贴壁生长的细胞。洁净区,并不是没有细菌,而是细菌的数量非常少,国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米,沉降菌数不得超过1个每培养皿。而国外的标准比我国的还要高一点,要求的数量更少。 所以在我们的洁净操作台里,并不是真正一个细菌都没有的,所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。所以处理细菌污染的重要原则就是:无限地稀释细菌的浓度,无限地减少细菌的数量!
1) 将污染的培养液倒掉,转烧瓶口,加入10mlPBS,适当晃动清洗培养瓶,然后倒掉。转烧瓶口。
2) 继续加入10mlPBS,同样方法晃动,清洗培养瓶,然后倒掉。
3) 继续加入5mlPBS,同样方法洗瓶,主要是培养面,然后倒掉。
4) 重复步骤3再洗。
5) 重复步骤3再洗。
6) 加入3-5ml双抗,洗瓶,静置3-5分钟,然后吸出。
7) 加入3ml双抗,洗瓶,静置3-5分钟,然后吸出。
8) 再加入5mlPBS洗瓶,然后吸出。
9) 加入10ml培养液,加入2ml双抗,放置培养箱培养,5小时之后,倒掉培养基,加入PBS洗瓶两次,然后加入胰酶消化,吹打后置于离心机800-1000r/min离心,然后洗一次。置于新的培养瓶里培养,培养体系加入2ml双抗。
10) 24h之后,视情况换液,若仍然污染严重,培养基浑浊,重复以上步骤,若看不到污染物,则继续步骤1)、3)、4)、6)、8),然后加入培养液培养,培养体系加入2ml双抗.
11) 24h之后,若仍污染严重,可再重复一次,若还污染只能弃之(不过一般没有出现这种情况),若镜下不见污染物,则换液PBS洗瓶,正常培养。

很多人有个误区,认为进口血清都是贵,其实不然。GIBCO的 NCS,马血清,都比国产的便宜的多,质量好的多。只有FBS才很贵,很多时候国产血清往往是污染源,所以用国产血清要严格监控状态。
以上方法主要是针对贴壁生长的细胞,在操作的过程中,一定要小心操作动作,轻柔缓慢,切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。以上方法操作得当,基本上都能救活你的细胞。当然如果你的细胞仍有富余或者冻存的,我还是建议你把污染的扔掉,再复苏方便省事。这个拯救细胞还是主要针对你就只剩这一瓶细胞无路可退的时候。欢迎大家讨论!

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