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如何评估Real-time qPCR定量检测?

一、Real-time qPCR定量方法

可以分为绝对定量和相对定量。

绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线,在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较,从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA,体外转录的RNA,或者是体外合成的ssDNA。

相对定量可以分为比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,也称之是 2-∆∆Ct 。

1. 绝对定量

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Y=-3.432X+34.638;R2= 0.995, E=95%,所以可以进行数据分析。 如果未知样品的   Ct=25, 代入方程: 25=-3.432X+34.638, 所以: X=2.8 Copies=10^2.8

2. 2-∆∆Ct定量

图片5

3. 其他定量方法

图片6

二、 影响Ct值的关键因素

1.模板浓度

模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间。

2.反应液成分的影响

任何分子的荧光发射都受环境因素影响—-比如溶液的pH值和盐浓度。

3.PCR反应的效率

在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增,与PCR扩增效率高的条件下相比,可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来,反应效率在90-110%之间都是可以接受的。

三、如何评估实时定量PCR反应的效果

  1. PCR扩增效率:为了正确地评估PCR扩增效率,至少需要做3次平行重复,至少做5个数量级倍数(5 logs)连续梯度稀释模板浓度。
  2. R2值:另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2,它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)来准确预测X值(量)。如果R2等于0,你就不能通过Y值来预测X值。R2值大于0.99时,两个数值之间相关的可信度很好。
  3. 精确度: 标准偏差(standard deviation,偏差的平方根)是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值,那么标准偏差就小;如果许多数据点都远离平均值,则标准偏差就大。实际上,足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限理论来证明,独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。如果PCR反应效率是100%,那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度,标准偏差就必须小于等于0.167。标准偏差越大,分辨2倍稀释的能力就越低。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释,标准偏差必须小于等于0.250。

4.灵敏度:无论CT绝对值是多少,任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为1的系统都达到了灵敏度的极限。PCR效率是决定反应灵敏度的关键因素。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是,低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。相反,它会遵循泊松分布,即进行大量的平行重复,平均应该含有一个拷贝的起始模板,实际上约37%不含有拷贝,仅有约37%含有1个拷贝,约18%实际上含有两个拷贝。因此,为了更可靠地检测低拷贝,必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性,并克服泊松分布的限制。

评价荧光PCR结果的标准

因素 建议 指标
效率 5个数量级梯度稀释 Slope ~ -3.3
R2 > 0.99
精密度 至少3个重复 标准差 < 0.25(0.5或者1个Ct之内)
灵敏度 增加低浓度样本的重复数 统计分析

 

除了这些因素,还必须评估和验证合适的实验对照(如无模板对照,无 反转录酶对照等)以及模板质量。

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