嘌呤霉素筛选标记的病毒滴定 Protocol

关于使用嘌呤霉素筛选标记的慢病毒或逆转录病毒进行病毒滴定的 protocol，整理了一个常用且较为权威适用于慢病毒系统：

【嘌呤霉素筛选法的病毒滴定 Protocol】

原理简述： 将病毒感染宿主细胞，使用嘌呤霉素筛选，仅有成功整合了抗性基因的细胞能存活。最后通过计数存活细胞（克隆或整体密度）来估算病毒滴度。

实验材料： 病毒上清；

HEK293T 或其他易感染细胞（如 NIH3T3、HeLa）；

嘌呤霉素（浓度需先测定敏感性，最常用浓度范围 1–10 μg/mL） 6-well 或 24-well 板 ；

英格恩Envirus病毒感染增强试剂

实验步骤：

1. 细胞接种 接种细胞至 6-well 板，每孔约 1–2 × 10⁵ 个细胞，目标是在感染时约 30–50% 密度，利于单细胞形成克隆。

2. 病毒感染（第2天） 用不同梯度稀释的病毒上清感染细胞（例如 1:10、1:100、1:1000），加入英格恩Envirus病毒感染增强试剂，孵育 24 小时；

3. 更换培养基 感染 24 h 后，更换为新鲜完全培养基；

4. 嘌呤霉素筛选 感染后 48–72 小时开始添加嘌呤霉素 用预先测定好的最低杀死未感染细胞的浓度（一般 1–5 μg/mL） 持续筛选 3–7 天，直到未感染对照孔中所有细胞死亡；

5. 结果分析

染色（如 crystal violet）或用显微镜计数存活细胞簇/克隆数 记录在某个稀释度下存活克隆数量

滴度计算： 滴度 Tu/mL=存活克隆数 × 稀释倍数 × 1000/感染时加入病毒的体积（μL）

例如： 加入 10 μL 的病毒（1:100 稀释），看到 20 个克隆 滴度 = 20*100*1000/ 10 = 2 × 10⁵ TU/mL

参考来源与权威支持：

1）Addgene 官方 Protocol: “Lentivirus Titering by Antibiotic Selection”

2）SBI 的慢病毒操作手册

3）Engreen英格恩病毒感染增强试剂操作手册

4）教科书参考：《Current Protocols in Molecular Biology》

Tips： 一定要预先做嘌呤霉素 kill curve，确定最小有效浓度 嘌呤霉素法测的是“功能性滴度”——能表达抗性并整合的病毒颗粒数，而不是总颗粒数 如果需要更高通量或更快的滴定，可以考虑结合 GFP/RFP marker 的 FACS 滴度