英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
文献标题：Extracellular RNAs-TLR3 signaling contributes to cognitive impairment after chronic neuropathic pain in mice
影响因子：Signal Transduction and Targeted Therapy 是Nature旗下期刊，2023年影响因子约为39.3，属于医学、分子生物学、药理学领域的顶级期刊。
文献概要：
该研究探讨了慢性神经性疼痛导致认知障碍的机制，重点聚焦于细胞外RNA（exRNA）特别是双链RNA（dsRNA）通过激活Toll样受体3（TLR3）信号通路，进而引发海马区神经炎症、细胞凋亡和突触可塑性损伤，最终导致认知功能下降。
采用英格恩（Engreen）产品的实验部分
实验目的：在神经元水平特异性下调 TLR3，以验证其在 CCI 所致认知障碍中的必要性。
实验设计
- 病毒载体
• 产品：rAV-hSyn-mCherry-5’-miR-30a-shRNA-3’-miR-30a-WPREs（由 Shumi Technology 构建）
• 启动子：hSyn（人突触素启动子），确保仅在神经元内表达。
• 标记：mCherry 红色荧光，便于追踪转导效率。
• 靶序列：TLR3-shRNA（miR-30a 骨架），用于敲低 TLR3 mRNA。 - 病毒稀释与质控
• 使用 Engreen 转染试剂（Engreen, Beijing, China）按说明书稀释病毒储液，获得滴度 1×10¹² vg/mL 的工作液。
• 通过 qPCR 测定实际滴度，确保批次间差异＜10%。 - 立体定位注射
• 动物：8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠，体重 20–25 g。
• 麻醉：1% 戊巴比妥钠腹腔注射（50 mg/kg）。
• 固定：使用 RWD 立体定位仪。
• 坐标（相对于 Bregma）：
– 前-后：−2.00 mm
– 左-右：±1.80 mm
– 背-腹：−1.70 mm
• 注射：使用 NanoFil 33G 针头，每次 0.2 µL，速度 0.1 µL/min；留针 5 min 后缓慢退针。
• 组别：
– AAV-TLR3 shRNA（AAV+）
– AAV-scramble shRNA（AAV−，对照） - 术后处理
• 缝合头皮，术后 3 d 内腹腔注射美洛昔康 1 mg/kg 镇痛。
• 3 周后灌流取脑，荧光显微镜验证 mCherry 表达；Western blot 检测海马 TLR3 蛋白下调效率（>70%）。 - 体外验证（补充）
• 对原代海马神经元（来自 WT 或 TLR3 KO 胚胎）转染 Engreen 试剂稀释的 AAV-TLR3-shRNA，72 h 后免疫荧光共染 dsRNA/TLR3，确认敲低效率及 dsRNA-TLR3 共定位减少。
实验意义：
- 机制揭示：首次阐明外周神经损伤后释放的dsRNA通过血液进入中枢，激活海马TLR3，导致认知障碍；
- 治疗靶点：证明TLR3敲除或使用dsRNA/TLR3抑制剂可显著改善认知功能，提示该通路为潜在治疗靶点；
- 转化价值：为慢性疼痛患者伴发认知障碍提供了新的病理机制解释和干预策略；
- 方法学贡献：使用AAV神经元特异性敲低TLR3，结合行为学、分子生物学和细胞实验，系统验证了假设。
总结：
该研究不仅具有高度的科学创新性，还在转化医学和药物开发方面具有重要价值，为治疗慢性疼痛相关的认知障碍提供了新的理论基础和实验依据。Engreen病毒感染增强试剂在本研究中被用于 AAV-TLR3-shRNA 病毒的体外稀释及体内立体定位注射，确保病毒颗粒稳定、高效转导神经元，为后续特异性敲低 TLR3 并验证其在慢性疼痛所致认知障碍中的关键作用提供了可靠工具。