英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
- 答：你描述的策略（铺板加药做qPCR，转染后加药做WB）是合理的，并且遵循了两种检测方法对时间需求的不同逻辑：qPCR关注转录早期/中期，WB关注蛋白积累的中/后期。
- 这不是唯一方案：
- qPCR： 有时也可以在转染后某个时间点（如6-12小时）加药，再培养足够时间（如再培养18-36小时）后收样，总处理时间也可能达到24-48小时。这取决于药物起效速度和你想观察的转录事件。
- WB： 如果药物起效非常慢，或者你想观察非常早期的蛋白修饰变化（如30分钟、1小时、2小时的磷酸化），完全可以在转染后更早或更晚的时间点加药，并在加药后较短时间收样（如加药后30min-2h）。如果研究药物对基础蛋白水平的影响（非转染依赖），也可以在铺板时就加药，处理更长时间（如48-72小时）后直接收样做WB，无需转染。
- 最重要的决定因素：
- 药物的作用机制和起效时间： 查阅文献或预实验确定药物达到最大效应所需的时间。
- 目标分子的表达/激活动力学： 你的目标基因mRNA或蛋白在转染后何时达到峰值？药物影响的通路节点上下游分子动力学如何？
- 实验目的： 你是想研究药物对基础表达的影响？对转染诱导表达的影响？对快速信号事件（磷酸化）的影响？还是对长期蛋白稳定性的影响？
- 细胞类型和转染效率： 不同细胞对转染和药物的耐受性不同。
- 药物溶剂对照： 无论何时加药，必须设置相应的溶剂（如DMSO, PBS等）对照组，且对照组和药物组的处理时间、换液操作等必须完全一致。
建议：
- 查阅文献： 查找研究类似药物、类似靶点或类似实验体系（细胞类型+检测方法）的文献，参考他们设定的加药时间点。
- 进行预实验： 这是最可靠的方法。 针对你的具体药物、细胞、质粒和检测方法，尝试不同的加药时间点（例如：
- 对于qPCR：比较铺板加药24h后转染 vs 转染后6h/12h加药再培养至总时间24h/48h收样。
- 对于WB：比较转染后12h加药处理24h/36h/48h vs 转染后24h加药处理24h/48h vs 铺板加药处理48h/72h（可能需要更高浓度或更长时程）。
- 监测转染效率： 无论采用哪种方案，建议在正式实验时共转染一个报告质粒（如表达GFP的质粒），并在加药前/收样前观察荧光，确保各组间转染效率一致，否则结果难以解释。
- 关注细胞状态： 密切观察不同处理组细胞的形态、密度和死亡率，确保实验条件在细胞可耐受范围内。
结论：
你提出的“铺板加药24小时后转染做qPCR”和“转染12小时后加药做WB”是两种非常常见且通常合理的实验设计策略，它们分别考虑了mRNA和蛋白质检测对时间窗口的不同需求。但这需要根据你的具体药物、靶点和实验目的通过预实验进行验证和优化。 核心原则是：确保药物有足够的作用时间达到效应，同时避免干扰转染过程或造成过度的细胞毒性。