英格恩技术博客 专注转染等实验

Real-Time qPCR常见的八大问题分析

1. 无Ct值出现

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  • 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
  • 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。
  • 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
  • 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

 

  1. Ct值出现过晚(Ct>38)

 

  • 扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。
  • PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
  • PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

 

  1. 标准曲线线性关系不佳

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  • 加样存在误差:   使得标准品不呈梯度。
  • 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。
  • 引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针
  • 模板中存在抑制物,或模板浓度过高

 

  1. 负对照有信号

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  • 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
  • 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
  • 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。
  • 模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

 

  1. 溶解曲线不止一个主峰

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  • 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
  • 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
  • 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。
  • 模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

 

  1. 扩增效率低

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  • 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
  • 反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
  • 反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板
  • 适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。

 

  1. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线产生,如何判断?

 

判断标准:扩增效率,灵敏度,特异性

如果扩增效率在90%-110%,都是特异性扩增,都可以把数据用于分析。

 

  1. 扩增曲线的异常扩增?比如“S”型曲线?

 

  • 参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时,选NONE)
  • 模板的浓度太高或者降解
  • 荧光染料的降解

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