293T转染后细胞大片脱落漂起，先查这几点

利益相关：我在英格恩工作，下面拿我们家的 Entranster-H 举例说用量，其他试剂也适用同样的思路。

结论前置：293T 转染后大片脱落，最常见的原因是试剂用量偏高、转染时细胞汇合度不合适、以及转染体系里带了双抗。先把试剂(μl):DNA(μg) 降到 1:1 以下，转染当下用无双抗培养基，贴壁细胞汇合度控制在 60-80%，这三条先排查。

下面按重要性排一下我建议的排查顺序。

1. 试剂用量是不是给多了

这是脱落最常见的原因。以 6 孔板为例，Entranster-H 的常规用量是 5μg DNA + 5μl 试剂，各自用 50μl 无血清稀释液稀释，培养基 2ml。如果细胞已经出现脱落，先把试剂降到 1:1(μl:μg) 以下试。各容器的常规用量见下表，可以对照自己是不是加超了。

2. 转染时细胞状态和密度

贴壁转染建议汇合度 60-80%，6 孔板提前一天铺 5-8×10⁵ cells/孔。铺得太密，转染后细胞更容易成片漂起。另外细胞代数也要留意，贴壁细胞建议 20 代以内；HEK293T 长期培养容易丢失 T 抗原，状态会越来越差。

3. 双抗和培养基

转染当下及转染前 4-6h 用无双抗培养基，4-8h 换液时可以换回含双抗的完全培养基。双抗在转染时存在会加重毒性表现。

4. 稀释液和复合物制备

稀释液用 OPTI-MEM 或无血清 DMEM，不能用 PBS 或含血清培养基。制备时试剂稀释液室温静置 5 分钟，缓慢加入 DNA 稀释液，吹吸 8-10 次或涡旋 3-5 秒，室温静置 15-20 分钟，不要超过 25 分钟。孵育时间过长或 DNA 浓度过高，复合物会呈乳白浑浊，这种复合物加进去细胞状态通常不好。

5. 加样手法和换液时机

沿孔壁缓慢滴加，前后或左右轻摇，不要画圈。有毒性表现可以在转染后 4-8 小时换液，6-8h 换液毒性更低；需要 Trizol 提 RNA 的话 4-8h 必须换液。

6. 质粒质量

内毒素 <0.1EU/μg，OD260/280=1.8-2.0，OD260/230>2.0，浓度>500ng/μl。内毒素高会表现为转染后 24-48h 缓慢凋亡，和急性脱落不太一样，但一起查了省事。

常用容器用量对照（Entranster-H）

| 容器 | DNA | 试剂 | 稀释液(各) | 培养基 |
|—|—|—|—|—|
| 96-well | 0.25μg | 0.25μl | 5μl | 100μl |
| 48-well | 0.5μg | 0.5μl | 10μl | 200μl |
| 24-well | 1μg | 1μl | 25μl | 500μl |
| 12-well | 2μg | 2μl | 25μl | 1ml |
| 6-well | 5μg | 5μl | 50μl | 2ml |
| 60mm/T25 | 10μg | 10μl | 125μl | 5ml |
| 100mm | 25μg | 25μl | 500μl | 15ml |

96/48 孔试剂只有 0.25-0.5μl，建议按 8-12 倍量预混试剂稀释液再分装，减少移液误差。共转多个质粒时，DNA 量是各质粒之和，试剂用量不变。

脱落排查顺序表

| 步骤 | 操作 |
|—|—|
| 1 | 试剂量下调 20-30% |
| 2 | 接种密度降 10-20% |
| 3 | 转染前 6-12h 血清饥饿预适应 |

如果是反向转染出现的脱落，也按这个顺序排查。反向转染 6 孔板接种 1.0-1.5×10⁶ cells/孔，约正向的 2 倍，复合物制备后 30 分钟内接种，用无双抗重悬。

效率不理想时怎么调

如果脱落问题解决了但效率只有 20-50%，可以做试剂(μl):DNA(μg) 0.5:1、1:1、1.5:1 的梯度；首次用某个细胞系可以做 3×3 梯度，比例 × 贴壁汇合 50/65/80%。

选型上如果还拿不准用哪款，可以参考这个选型指南：https://www.engreen.com.cn/转染试剂选型指南/

如果是做慢病毒或 AAV 包装时碰到脱落，除了上面这些，还要看包装比例和收毒时间，慢病毒转移质粒:psPAX2:pMD2.G = 4:3:1，>10kb 的转移质粒提到 5:3:1；AAV 是 1:1:2。这类场景欢迎在评论区说下具体体系，我再帮你看看。