2022年 5月 17日, 星期二
新闻

免疫球蛋白G ( IgG) 片段的水解(三)

基本方案3  胃蛋白酶水解IgG 成F(ab’)2 片段的摸索性试验

在此试验中摸索在两个不同pH 下IgG 的水解情况,因为IgG 在低pH 下会水解成Fab 片段或更小的片段。胃蛋白酶的水解比木瓜蛋白酶更剧烈,因此推荐的酶/抗体 (E/A) 比例以不超过1: 20 为佳。

注意:从IgG2b水解不能得到F (ab’)2 片段,用胃蛋白酶水解IgG2b,会得到相同分子质量的片段(120kDa) ,但这些是Fab/c片段(含一个Fab 片段和完整的Fe 部分)。

材料

  • 3mg/ml 纯化的IgG
  • pH4. 0 和pH5. 0 乙酸缓冲液:0.2 mol/L 乙酸钠,用冰醋酸调至所需pH
  • 0. 1mg/ml 胃蛋白酶 :溶于pH4. 0 乙酸缓冲液
  • 0.1mg/ml 胃蛋白酶 :溶于pH4. 5 乙酸缓冲液
  • 2mol/L Tris 碱
  • PBS

流程

  1. 将2ml 3mg/ml 纯化的lgG 分别对着200ml 乙酸缓冲液(pH 分别为4.0 和4. 5) 透析, 4°C 透析4h 。
  2. 用对应pH 的乙酸缓冲液作为空白对照测 A280 值,确定两种透析后lgG 的浓度 ,用对应pH 的乙酸缓冲液将两种lgG 水解液的浓度调至2mg/ml 。
  3. 将100μl 2mg/ml lgG pH4. 0 加入16 个标号的微量离心管中,将100μl 2mg/ml IgG pH4. 5 加入另外16 个标号的微量离心管中。
  4. 将100μl 0.1mg/ml 胃蛋白酶液pH4. 0 加入8 个lgG pH4.0离心管中,将100μl 乙酸缓冲液pH4. 0 加入另外8 个IgG pH4. 0 离心管中。将100μl 0.1mg/ml 胃蛋白酶液pH4. 5 加入8 个lgG pH4. 5 离心管中,将100μl 乙酸缓冲液pH4. 5 加人另外8 个IgG pH4.5 离心管中[在两种不同pH 溶液中酶/抗体(E/A) 比例为1 : 20] 。
  5. 将所有离心管置于37°C 水浴,分别在1h 、2h 、4h、6h 、12h、24h 和48h 时从四组各8 个离心管中取出1 个离心管,在取出的离心管中加入40μl 2mol/L Tris 碱终止酶解反应。
  6. 将水解液转至透析袋中,并准备微量透析槽,在4℃ 下对着1LPBS 透析4h。
  7. 用10 %非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析,每管上样量为80μl, F(ab’)2  片段分子大小为110kDa , 较小分子质量(约50kDa) 的条带可能是Fab’ 片段。从中确定获取最大量F(ab’)2 片段的最佳条件,用于基本方案4 中。

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