2022年 1月 28日, 星期五
新闻

监测慢病毒载体储备液中的可复制型病毒

一、试剂

完全培养基、DMEM 培养基、胎牛血清(FBS )、慢病毒载体储备液、OptiMEM-I、青霉素/链霉素( P/S ) 溶液(100×)、磷酸盐缓冲盐水( PBS )、聚凝胺(海美溴铵) ( 8mg/mL ) 、QuickTiter 慢病毒滴定试剂盒(慢病毒相关的HIV p24 )、293T 细胞、胰蛋白酶-EDTA ( 0.05%)

二、设备

培养板(12 孔)、恒湿细胞培养箱( 37 °C, 5% CO2)、血细胞计数器、微量移液器、450nm 可读微孔板酶标仪、带有无菌滤芯的移液器吸头(2 0μL 、2 00μL 和1000μL)、注射器式PVDF 膜过滤器( 0.45μm )、T-25 培养瓶、试管,无菌( 1.5mL )

三、方法

1 在转导前1 天, 向12 孔板上含lmL 完全培养基的每个孔中接种3 X105个293T 细胞。37 °C 、5%CO2细胞培养箱培养过夜。

2 第1 天,将250μL 未浓缩载体储备液与含有16μg/mL 聚凝胺(1: 500 稀释8mg/mL聚凝胺储备液)的250μL 完全培养基混合。对于浓缩慢病毒载体储备液,加5μL 至含有8μg/mL 聚凝胺的0.5mL 完全培养基中。重复制备3 次。准备含有等体积OptiMEM-I 的试管,作为慢病毒载体储备液空白转导对照。

3 吸弃一个孔中的完全培养基,更换为含终浓度8μg/mL 聚凝胺的0.5mL 载体稀释液,重复该操作,载体储备液和空白对照各3 个复孔。在细胞培养箱中, 37 °C 、5%CO2培养过夜。

4 次日,将转染孔( 载体储备液和空白对照) 中的上清移至无菌l.5mL 管中,再加入37 °C 预热的lmL 完全培养基。

5 在室温下以500g 离心第1 天的上清液10min 。将上清液转移到1 个新的试管中,标记为“第1 天”,标明载体或空白对照。- 80 °C 储存。

6 第4 天,弃慢病毒和对照转染孔中的上清液,用lmL 的PBS 洗涤细胞。弃PBS,加入0.5mL 0.05 %胰酶-EDTA, 室温孵育5min 。加入0.5mL 完全培养基,并通过反复吹打悬浮细胞。分别转移每孔中所有细胞至含5mL 完全培养基的T-25 培养瓶中(载体储备液和空白对照各需3 个培养瓶),在培养箱中继续培养。

7 . 第7 天,将培养上清液利用0.45μm 注射器式过滤器过滤到新的15mL 试管中,载体或对照均标记“第7 天” 。- 80 °C 储存。按照1 : 10 传代细胞, 每周2 次。

8 . 在第15 、21 和30 天重复步骤7 。

9 使用QuickTiter 慢病毒滴定ELISA 试剂盒测定所有上清液。对照包括载体储备液和293T 细胞上清液。第1 天的上清液中应含有来自慢病毒载体储备液的p24, 但它应该逐渐消失,在之后的时间点检测不到,与空白转导上清液水平相当。

配方

聚凝胺(海美溴铵) (8mg/mL)
溶解100mg 的凝聚胺(海美溴铵)于12.5mL 水中。利用0.22μm 过滤器除菌并存储在4 ℃

完全培养基

试剂 体积( 1L 中含) 终浓度
DMEM 890mL  
FBS 100mL 10%
P/S 溶液(100 X) 10mL 1X

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