英格恩技术博客 专注转染等实验

cDNA的制备与检测

[实验原理]

总RNA,经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA,以寡聚(d丁)为引物,经反转录合成双链cDNA。先用反转录酶合成第一条cDNA链;经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶,以第一条链cDNA的3’末端结构为引物合成第二链,最后形成双链cDNA。

[仪器、材料与试剂]

(一)仪器和材料

紫外线透射仪、移液枪、琼脂糖凝胶电泳系统

(二)试剂

特异引物、逆转录试剂盒

[实验步骤]

(一)cDNA的合成

1、取约9uL mRNA,依次加入:第一链缓冲液4uL,RNA酶抑制剂1 uL,Oligo(dT)引物2uL,dNTP混合液2uL AMV逆转录酶2uL,混匀,离心10min,42℃水浴1h。

2、在冰上于第一链反应产物中,加入以下试剂:第二链缓冲液然40uL,RNA酶H 1uL,大肠杆菌DNA聚合酶5uL,DEPC处理过的水至100uL,混匀,离心10s,12℃、22℃、65℃水浴各1h。

3、加入T4DNA聚合酶,振荡混匀后离心10s,37℃水浴10min。

4、加入10uL 200mmol/L EDTA和2ul SDS(10%,W/V)

5、加入80uLTE,20uL 3mol/L醋酸钠,400uL乙醇,-20℃放置15min。

6、15000rpm 离心15min。

7、弃上清,稍晾干至无乙醇味,加40uLTE溶解沉淀,即为合成的cDNA。

(二)cDNA电泳检测

取约5ul反应产物,在1%琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,紫外灯下检测,呈现出大小在200—10Kb的拖带,其中重心区域小1—4Kb之间,这说明反转录完全,得到了高质量的cDNA。

扫描二维码,随时阅读沟通。

英格恩技术的微信

Check Also

导致western Blot发光(ECL)“背景高”的原因有哪些?

Western Blot发光经 …

发表评论

邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注

*