2022年 5月 17日, 星期二
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如何制备血清减量或无血清培养基?

目前,人们普遍认可单一类型细胞的最合乎生理的培养基是添加了蛋白质的、并且含有适当浓度的各种成分以及细胞外基质组分的限定培养基。

材料

  • 基础营养培养基,如DMEM
  • 营养物质:无机盐,氨基酸,维生素
  • 微量元素
  • 添加剂:生长因子和激素,其他各种培养基成分(见表1)
  1.  凭经验先选用特别适合某种细胞生长的培养基,减少未限定培养基成分的浓度,直至细胞增殖能力降低,但活力仍较高。

  2. 进行各种营养成分的不同浓度影响细胞增殖的实验。将已知的对至少一种细胞增殖有影响的营养成分,按以下分组进行测定:
    a. 能源(葡萄糖和谷氨酰胺);
    b. 微量元素和电解质(Na+ 、Cl 、K + 、Ca2 + 、Mg2+  Cu2+ 、Fe2+ 、Se 、H2P04和HC03 ) ;
    c. 氨基酸(谷氨酰胺、胱氨酸、半胱氨酸、组氨酸) ;
    d. 维生素( 生物素、维生素B12 );
    e. 脂类和脂的前体物(油酸、亚油酸与脂肪酸结合的胆固醇-游离BSA; 与组分
    噙A连接的未限定脂类;低密度脂蛋白、乙醇胺或磷酸乙醇胺)。
    确定大多数限制因子的最适浓度范围,并且确定中心范围的浓度;重复生长实
    验,依次确定并优化每种限制因素。

  3. 降低未限定的添加成分的浓度,重复优化步骤。继续优化营养成分,直到其缩减的浓度得不到补偿。

  4. 优化培养基中的生长因子、激素、转运蛋白及黏附因子等添加物质,可以单独试验,或者与培养基营养成分联合应用试验。

低浓度血清和无血清培养基成分a

成分 终浓度 储存浓度
不确定添加物    
血清 5%~20%(v/v) 100%(v/v)
垂体提取物 5~100μg/ml 1~2mg/ml
条件培养基b 5%~50%(v/v) 100%(v/v)
能源    
葡萄糖 1~4. 5g/L /
谷氨酰胺 1~2mmol/L /
黏附因子    
胶原蛋白 I 型 10~50/μg/ml 3~4mg/ml
纤黏素 1~10μg/ml 0.5~1mg/ml
玻连蛋白 1~10/μg/ml 0.5~ 1mg/ml
激素    
胰岛素 1~10/μg/ml 1mg/ml
载体蛋白    
转铁蛋白 5~30μg/ml 1mg/ml
BSA(无脂肪酸) 0.5~4mg/ml 50mg/ml
微量元素    
硒,钠盐 1~20nmol/L 2μmol/L
脂类及其前体物    
乙醇胺 1~20μmol/L 2mmol/L
BSA 组分V 0.05~5mg/ml 50mg/ml
不饱和脂肪酸 1~10μg/ml 20~50mg/ml
甾酮 1~20μg/ml 2~4mg/ml
低密度脂蛋白 1~20μg/ml 1~2mg/ml

a. 储存液需要过滤除菌,将粉末状的葡萄糖和谷氨酰胺(或冷冻的分装液需融化)加入到重组的粉末状培养基中。

b. 条件培养基必须由研究者按照实验目的选择细胞自行配制。

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