2024年 7月 20日, 星期六
新闻

双脱氧法DNA 测序常见问题

问题

可能原因

解决方法

放射自显影片空白

 

DNA 聚合酶失活

标记物太旧

 

用对照引物、模板及试剂进行试验

 

试剂太旧

 

替换缺陷试剂

不正确或有缺陷的引物

 

 

不正确或有缺陷的模板,

 

 

曝光失误(如保留了保鲜膜,凝胶对着胶片的背面等

改正错误

整张放射自显影片太亮/标记物掺入不足

标记物太旧

 

采用新标记物

 

酶活性太低

 

采用新的酶制剂,在临用前才稀释并置于冰上

 

引物与模板复性不好

 

将引物复性温度最优化。如果选用双链模板,记住在复性前一定要碱变性

 

引物量不够

 

用对照DNA模板和引物进行试验,检测引

物的浓度。使用单链模板时需引物0.5

pmol, 双链模板需1 pmol

 

模板量不够

 

用对照DNA 模板和引物进行试验,用凝胶

检测模板浓度,每组反应用约0.5 pmol 模板DNA

 

 

曝光或放射自显影失误

 

重新曝光,必要时更换显影试剂移去保鲜膜

所有泳道背泉都较高

DNA 模板不纯

检查对照DNA 是否存在同样的问题。如没

有,重新制备新的模板;如果是双链模板,用RNA 酶A 处理,酚抽提,乙

醇沉淀;必要时,用CsCl 提纯

DNA

整个泳道中条带全部扩散或模糊

DNA 模板不纯

 

检查对照DNA 是否存在同样的问题.如没

有,重新制备新的模板。如果是双链模板,用RNA 酶A 处理,酚抽提,乙醇沉淀,必要时,用CsCl 提纯DNA

 

聚丙烯酰胺凝胶质量差

 

用高质量的试剂配制新的丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺及缓冲液。储液保存于4℃暗处

 

凝胶灌制后不久就使用

 

让凝胶聚合更长时间

 

凝胶中缓冲液的浓度与电泳槽中的浓度有差异

 

从同一1OX TBE 储液出发,配制凝胶及电泳液

 

样品煮沸过度

 

如果样品将在多块凝胶中加样.从反应混合物中分别取3 μl 小份样品加热并上样

 

 

样品在电泳前未经变性

 

95’C 水浴加热样品2~3 min

 

在太高温度下进行凝胶电泳

用温度计监测凝胶温度,保持在65°C 以下,必要时,在稍低的电压下电泳以保持低温

凝胶部分区域条带模糊

凝胶或凝胶上的塑料包装膜有皱纹

详见测序胶罐装方式

 

胶片没有与凝胶夹紧

在凝胶背面插入滤纸以填充X 射线片盒的多余空间,必要时,多用些夹子

在凝胶450~550核苷酸处的所有条带扭曲

样品中含有>0.5 %甘油

用不含甘油的稀释液稀释DNA 聚合酶

整块胶所有的4 条泳道上均同时出现条带

酶活性低

用新的酶制剂,临用前才用合适的稀释液或1X 测序缓冲液稀释

缓冲液或核苷酸混合物有误

配制新的混合物试剂

试剂被污染

配制新的试剂

条带间隔失常;条带丢失两、三个泳道的同一位置上同时出现条带,但仅见于特定区域

压缩(在凝胶电泳条件下新合成DNA链的二级结构所致)

 

整块凝胶上均见不只一个泳道的同一位置上出现条带

DNA 制剂中含有2 种不同的DNA 分子,这些分子产生重叠序列

重新从单菌落或单个噬斑中制备新的DNA

引物复性于模板的第二位点

调整引物/模板的比例及复性温度

 

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