2022年 1月 28日, 星期五
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Trizol法提取总RNA的流程

1.样品处理:

  • 培养细胞:收获细胞1~5×107,加入1ml Trizol(异硫氰酸胍/酚)(在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol),混匀;用1ml注射器反复抽取(约30次)以破裂细胞及剪切DNA,室温静置5min(使核酸蛋白复合物完全分离)。
  • 组织:取50~100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置5ml EP管中,加入1ml Trizol充分匀浆,室温静置5min。

2.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

3.加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15~30s,静置2~3min。

4.4℃离心,12000g×15min。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

5.小心吸取上清至一新的DEPC处理过的1.5ml EP管中(如要分离DNA和蛋白质可保留有机相),加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。

6.4℃离心,12000g×10min。离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

7.弃上清,于沉淀中加入75%乙醇(冰冷)1ml,振摇,充分洗涤沉淀。

8.4℃离心,12000g×5min。

9.弃上清,短暂离心,小心吸取弃去上清。

10.加入适量(20μl)DEPC (Rnase Free)H20溶解RNA(65℃促溶10~15min)。

11.取2μl进行电泳,其余-80℃保存。

 

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