2022年 1月 28日, 星期五
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Trizol法提取总RNA的原理及注意事项

原理:Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中,Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

Trizol试剂可用于小量样品(50~100mg组织,5×106细胞),也可用于大量样品(≥1g组织或≥107细胞),对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用,可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应,提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染,可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。

本试剂为红颜色,便于区分水相和有机相,同时最大限度的保持RNA的完整性。

保存条件:2~8℃避光保存12个月。

实验前需要准备的试剂:

Trizol,氯仿,异丙醇,75%乙醇(用RNase-Free水配制),RNase-Free水。

实验前需要准备的物品:

1ml注射器,1.5ml EP管(DEPC处理过),大、中、小号枪头(DEPC处理)

样品前处理注意点:

  • 选择新鲜血液,不得超过4小时。
  • 选择新鲜组织,生长旺盛的组织。
  • 选择新鲜的幼嫩组织。
  • 选择处于生长旺盛的时期收集细胞。

RNA纯化要求:

  • 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用的物质。
  • 排除有机溶剂和金属离子的污染。
  • 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。
  • 排除DNA分子的污染。

RNA提取的注意事项:

  • 杜绝外源酶的污染。
  • 严格戴好口罩,手套。
  • 实验所涉及的离心管,Tip头,移液器杆,电泳槽,实验台面等要彻底处理。
  • 实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保RNase-Free。
  • 阻止内源酶的活性。
  • 选择合适的匀浆方法。
  • 选择合适的裂解液。
  • 控制好样品的起始量。
  • 明确自己的提取目的。
  • 任何裂解液系统在接近样品最大起始量时,提取成功率急剧下降。
  • RNA提取成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功,而不是得率。

Rnase污染的10大来源

  • 手指头
  • 枪头
  • 水/缓冲液
  • 实验台面
  • 内源Rnase
  • RNA样品
  • 质粒提取
  • RNA保存
  • 阳离子(Ca,Mg)
  • 后续实验所用的酶

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