2022年 8月 17日, 星期三
新闻

SDS 碱裂解法制备质粒DNA: 大量制备

近些年来,随着PCR 技术的出现,以及DNA 克隆和测序方法的发展,对大量质粒载体和重组子的需求也大大减少。因此,本方案曾一度广泛应用,但已经被更为快速和简便的柱纯化方法代替。在本方案中,通过碱裂解法的放大( Bimboim and Doly 1979 ) ,质粒DNA 可从清亮的细菌裂解物中通过含有溴化乙锭的CsCl 梯度离心来进行纯化。

无论是高拷贝数的质粒还是低拷贝数的质粒,通过这种方法可以得到每毫升3~ 5μg的DNA 。重组子的质粒一般产量较少,这取决于克隆的DNA 片段的大小和特点。

材料

试剂

琼脂糖凝胶(见步骤8 和19)

碱裂解液I<A>

  • 若用柱层析进一步纯化所制备的质粒DNA,无菌的碱裂解液Ⅰ 在使用前可补充适当体积的无DNA 酶的RNA 酶( 20mg/mL, 胰RNA 酶),使终浓度为l00μg/mL , 若用其他方法纯化DNA , 不推荐在此步骤中加RNA酶。

碱裂解液II<A>

  • 现配现用,室温使用。

碱裂解液III<A>

  • 用于筛选质粒的抗生素

转化了目的质粒的细菌克隆

氯霉素(3 4mg/mL ) (可选;见步骤4 )

乙醇

异丙醇

溶菌酶( l0mg/mL )

限制性内切核酸酶

培养基( LB 、YT 或者Te1Tific Broth) <A> ,预热到37 °C

STE<A> ,冰浴

TE (pH8.0) <A>

设备

有盖的培养瓶( l25mL, 2L )

摇床,预设到37 °C

RC6 Plus 离心机带转头,合适容量( Thermo Scientific )

分光光度计

方法

细胞制备

  1. 挑取转化的细菌单菌落或用0.1 ~ 1.0mL 单菌落的培养物,接种到30mL 含有适当抗生素的培养基中( LB 、YT 或者Terrific Broth) 。

为确保培养物通气良好:

  • 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4 倍。试管盖要盖得松些。
  • 培养物要在剧烈振荡下培养。
  1. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期( OD600 约为0.6) 。
  2. 在含有500mL 的LB 、YT 或者Terrific Broth 培养液(预热到37°C) 及适当抗生素的烧瓶(2L) 中接种25mL 对数生长期晚期的菌液。将此培养液在37 °C 剧烈振荡(300cycles/min ) ,培养2.5h 。
  • 最后菌液的OD600 应为0.4 。由于不同菌株的生长速度不同,可稍微延长或缩短培养时间,使最终的OD 值为0.4 。
  1. 若质粒为低或中拷贝数的质粒,在培养液中加2.5mL 浓度为34mg/mL 的氯霉素,使其终浓度为170μg/mL 。
  2. 在37°C 以300cycles/min 振荡12 ~ 16h 。
  3. 取部分菌液(1 ~ 2mL) 到离心管中, 4°C 储存。2700g 离心15min 以收集余下的近500mL 培养物。弃上清,倒置离心管使残余上清流出。
  4. 用200mL 冰预冷的STE 重悬细菌沉淀,按步骤6 所述重新收集细菌并储存在-20°C 。
  5. 从步骤6 中取出的1 ~ 2mL 菌液中提取质粒, 并采用酶切和琼脂糖电泳分析此少量制备的质粒DNA, 以确定大量培养菌液中获得的质粒正确。

细胞裂解

 9.将步骤7 中冻存的细菌在室温下放置5 ~ l0min 使其解冻,用18mL ( l0mL ) 碱裂解液I 重悬。如果步骤4 中使用了氯霉素的菌液,则使用括号中的体积数。

 10.加2mL ( lmL ) 新配制的l0mg/mL 溶菌酶。

 11.加40mL (20mL) 新配制的碱裂解液II 。盖上离心管盖,轻轻颠倒数次,彻底混匀,室温放置5 ~ 10min 。

  • 延长超螺旋DNA 暴露于碱的时间会使其不可逆变性,所产生的环状卷曲DNA 不能被限制酶切割,而且它在琼脂糖电泳中的迁移率为正常超螺旋DNA 的2 倍,难以被溴化乙锭染色。从细菌中用碱裂解法提质粒时可能会看到微量的这种DNA 。
  1. 加20mL ( 15mL ) 冰浴冷的碱裂解液III 。盖上离心管盖,轻轻地振荡混匀(此时不应再有两个液相)。将离心管在冰上放置l0min 。

    在碱裂解液Ⅲ 中最好使用乙酸钾而非乙酸钠,因为十二烧基乙酸钾盐比钠盐难溶。

  2.  4 °C 用>20 000g 离心30min, 让转子自动停止,无须制动。将上清轻轻移入量筒中,弃去沉淀。
  • 不能形成紧密沉淀的原因一般是加入碱裂解液II 时没有充分混匀(步骤II ) 。如果细菌碎片不能形成紧密的沉淀,以20000g 再次离心15min, 将上清移入干净的离心管。转移时可用4 层纱布过滤上清,可以除去黏稠的基因组DNA 和蛋白质沉淀。

质粒DNA 回收

  1. 量取上清体积,将其连同0.6 倍体积的异丙醇一起移入一支干净离心管中并将其充分混匀,室温下放置l0min 。
  2. 在室温下以12000g 离心15min 回收核酸沉淀。
  • 若在4℃ 离心会使盐沉淀下来。
  1. 小心弃去上清,将离心管敞开盖,倒置于纸巾除去残余上清。在室温下用70%乙醇涮洗管壁,倒掉乙醇,并除去管壁的液滴。将离心管开口倒置于纸巾上使剩余乙醇挥发掉。
  2. 用3mL 含有2 .0μg/mL 无DNA 酶的RNaseA 的TE (pH 8.0) 溶解DNA 沉淀。轻柔振荡溶液。将DNA 保存于-20°C 。
  3. 质粒DNA 的纯化可用商业树脂进行柱层析
  4. 用DNA 测序及限制性酶切结合凝胶电泳分析确证质粒结构。

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