2022年 1月 28日, 星期五
新闻

PCR-SSCP实验步骤

一.样品制备

1.PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测,上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。

2.PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ul  SSCP上样缓冲液(变性缓冲液),然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。按照经验,扩增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加1ul,效果很好加0.5ul,如果不太好就适当增加1.5、2或3不等,同时加大上样缓冲液的量,比如加3ul的PCR产物,缓冲液加到8ul变性效果更好。

3.PCR产物变性。加好的样品进行离心,使样品集中在管底。PCR仪上95℃变性10分钟,立即取出PCR产物连同架子一同置于冰上静置5min,以免变性的产物复性。

注:3和4步可以在制SSCP胶第四步后,等胶凝的过程中进行。

  • 制胶
    • 1.装板。在所要进行实验的每一副玻璃板先用自来水冲洗,然后使用ddH2O冲洗,然后使用吸水纸将玻璃板擦拭干,然后再玻璃板上涂抹无水酒精,待2-3min酒精挥发。将玻璃板组装好放入凝胶架子中,两边及底部固定好,两玻璃板保持水平,然后将发条拧紧。(可用无水乙醇测试是否漏胶)。
    • 2.配胶。

甘油浓度50%的几种浓度大板胶(10ml下层胶,5ml 浓缩胶)配方(两块胶 1.0mm):

 

8%          

6%

30%PAGE

2.7ml

1ml

10×TBE

1ml

0.5ml

50%甘油

1ml

0.5ml

ddH2O

5ml

3ml

APS

70ul

70ul

TEMED

12ul

8ul

Total

10ml

5ml

甘油浓度50%的几种浓度小板胶(15ml下层胶,10ml 浓缩胶)配方(两块胶 1.5mm)

 

8%

6%

30%PAGE(4℃)

4.05ml

2 ml

10×TBE

1.5ml

1m

50%甘油

1.5m

1m

ddH2O

7.5ml

6ml

APS

105ul

70 ul

TEMED

12ul

12ul

Total

15ml

10ml

3.灌胶。配好胶后搅匀,灌入装好的玻璃板中,注意不能产生气泡,如果产生气泡把板立起,轻轻敲打可使气泡升出胶面,胶面与凹板上沿大约差0.5cm时插上梳子,要保证梳子齿和液面接触处没有气泡,一旦产生要拔出重插。

4.静置。灌好的胶平放或与水平成一比较小的角度(10o以下)静置水平桌面上30min左右使之充分聚合。

注:此时可以进行PCR样品变性,即第一部分的3、4步。

  • 上样

1.安板。PAGE聚合好后要及时拔出梳子(时间耽搁长后会使梳子很难拔出),拔梳子时要用力均匀以保持胶孔的整齐。用夹子把胶板固定在电泳槽上,凹槽的一面朝里,安板时首先使板的底边一端先接触电泳液,再缓慢地过度到另一端,以免产生大气泡(产生大气泡会使电泳条带弯曲)。

2.预电泳。从底槽把一些电泳液1×TBE吸到上槽,使液面高出玻璃板矮边1cm以上,并确保上槽不漏液。打开电源,大槽电压调到140-150V,小槽110-120V,预电泳10min左右。(0.1W/cm,10℃,1-3h)

3.点样。用微量进样器把准备好的样品按顺序加到胶孔中。由于边缘效应带型不整齐,每块板中最边上的两个孔最好不要点样。

4.电泳。大槽电压140-150V,小槽110-120V,温度在10-15℃,恒温电泳10个小时以上。

  • 染色

1.固定。把胶卸下,做好起始记号,放入70%乙醇中在摇床上固定15min。固定好后乙醇回收(可以重复使用5次左右),蒸馏水洗两遍,每遍3min左右。若同时染两块胶固定和洗脱都要适当增加时间。

2.染色。染色液(200ml染色液含3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml)染色30min,同时染两块胶要适当增加时间,需40min左右。倒掉染色液,洗3遍,每遍3min,同时染两块胶要适当增加时间。

3.显色。显色液(200ml显色液包含1%柠檬酸钠1ml,甲醛100ul)至清晰。倒掉显色液,加蒸馏洗脱3次停显。

(也可将凝胶浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色10min,在紫外灯下观察)

附录

  1. 甘油浓度50%的几种浓度大板胶(10ml下层胶,5ml 浓缩胶)配方(两块胶 1.0mm):

 

8%          

6%

30%PAGE

2.7ml

1ml

10×TBE

1ml

0.5ml

50%甘油

1ml

0.5ml

ddH2O

5ml

3ml

APS

70ul

70ul

TEMED

12ul

8ul

Total

10ml

5ml

  1. 2. 甘油浓度50%的几种浓度小板胶(15ml下层胶,10ml 浓缩胶)配方(两块胶5mm)

 

8%

6%

30%PAGE

4.05ml

2 ml

10×TBE

1.5ml

1m

50%甘油

1.5m

1m

ddH2O

7.5ml

6ml

APS

105ul

70 ul

TEMED

12ul

12ul

Total

15ml

10ml

3.10×TBE的配方:

108g Tris碱、55g硼酸、40ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)定容1L

4.变性buffer的配方

98%去离子甲酰胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯青FF、0.025%溴酚蓝

注意事项:

①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变, SSCP图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带,但有时有的DNA片段 可能只呈现一条SSDNA带,或者三条以上,这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果.

②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高,这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下,DNA的长度不会影响SSCP 的效果.

③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象,SSCP应在较低温 度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外,电压过高也是引起温度升高的主要原因,因此,在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时,开始的5min应用较 高的电压(250V),以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离,而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使 之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.

④SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量 的大小来分离的,而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的,因此,这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近,很难看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16–18cm以上,以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检测限则判定链的迁移率有改变,说明该DNA序列有变化,小于检测限则说明链之间无变化.例如,一般检测限定为3mm,那么当两带间距离在3mm以上,则说明两链之间有改变.另外检测限不能定的太低,否则主观因素太大,易造成假阳性结果.另外,SSCP 分析中其它条件,如PCR产物的上样量,PAG的交联度、以及胶的浓度等,都应根据具 体实验进行选择确定.

 

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