2022年 1月 28日, 星期五
新闻

电穿孔转化感受态E.coli TG1细胞的制备

一、材料和试剂

  1. 恒温旋转式摇床
  2. 三角烧瓶(容量为1或2L)
  3. 50ml灭菌离心管
  4. 低温高速离心机
  5. SB培养基
  • 细菌培养用胰化蛋白胨     20g
  • 细菌培养用酵母提取物      5g
  • NaCl                     0.5g
  • 去离子水                 950ml
  • 250mmol/L KCl溶液        10ml

以5N的NaOH调节溶液的pH值至7.0,加去离子水至1L,高压蒸气灭菌。

  1. 20%葡萄糖溶液
  2. 1mol/L MgCl2溶液
  3. 10%甘油

二、操作步骤

  1. 从新鲜的LB平板培养物中挑选一个TG1克隆,接种于10m1 SB培养基中。
  2. 37℃摇床培养过夜。
  3. 取2.5ml培养物转接于0.5L SB中,另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。
  4. 37℃培养直到OD600=0.7~0.8。
  5. 将培养物置于冰浴15min,然后4000r/min于4℃离心20min,弃上清。
  6. 将菌体重悬于1/2体积的预冷10%甘油中,4000r/min于4℃离心20min,弃上清。
  7. 重复第(6)步骤。
  8. 将菌体重悬于15ml 10%甘油,并转移至一支50ml的离心管中。3500r/min于4℃离心15min。小心地去掉上清,得到4~5ml细菌。迅速地将其吹打重悬;
  9. 分装成200μl或40μl 的小份,操作应在乙醇/干冰浴中进行。贮存于-70℃。
  10. 用pUC19质粒测试制备感受态细菌的转化效率,应达到109cfu/μg DNA。

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