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western-blot化学发光(ECL)的特异性差是什么原因?

特异性差,出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面:

1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。

2. 一抗是多克隆抗体,或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体,或降低抗体浓度,缩短抗体孵育时间,优化一抗和二抗的使用浓度。

3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量,延长洗膜时间,或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。

4. 目的蛋白在体内存在多种修饰形式,如乙酰化,甲基化,磷酸化,糖基化等。可查阅文献,用合适的方法去除蛋白的修饰,或选择合适的抗体。

5. 目的蛋白降解。重新准备蛋白样品,并加入足够的蛋白酶抑制剂。


6. 发光液质量问题,可选用发光清晰的ECL发光液,如Enlight。

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