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悬浮细胞的siRNA转染实验步骤

悬浮细胞的siRNA转染操作步骤,以24孔板siRNA转染为例
1.提前1天细胞种植
悬浮细胞:采用对数生长期的细胞,数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105,那么就用2×105的细胞进行转染。
2.转染过程  
⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA,加入一定量无血清稀释液,充分混匀,制成RNA稀释液,终体积为25μl。
注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
⑵取1ul的Entranster-R4000,然后加入24ul无血清稀释液体,充分混匀,制成Entranster-R4000稀释液,终体积为25μl。室温静置5分钟。
⑶将Entranster-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合,室温静置15分钟。转染复合物制备完成。
⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10%血清和抗生素)的细胞上,前后移动培养皿,混合均匀。
注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
⑸转染后6小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养24-96小时得到结果。
注意:1.siRNA转染后,继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果,继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。mRNA转染后,根据需要在24小时后得到结果。
2.在部分实验室,由于血清和培养条件等差异,转染后镜下培养基中可能出现少量黑点状沉淀,为转染试剂和血清中蛋白结合产物,不影响转染结果和细胞状态,可通过换液除去。

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