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RNA转染

都说RNAi很容易降解,转染效率很低,是真的吗?

RNAi就是利用降解双链RNA的酶系统,人工引入一段和目标RNA互补的序列,这样,在细胞内形成双链RNA,诱发降解机制,使目标RNA降解,无法被进一步翻译。 在转染过程中,有人就在担心,dsRNA的稳定性是相对于单链RNA而言的!RNA怎么办? RNAi中,标准的非修饰的siRNA确实容易降解,这不仅在保存过程中,而且在转染过程中。对siRNA的降解,可以合 …

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siRNA转染常见问题及解决方案

1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。 RNA浓度和转染试剂量的优化(24well) 1 2 3 4 RNA工作浓度 25nM 50nM 100nM 150nM 每孔RNA的量(pmol) 0.17μg(12.5pmol) 0.33μ …

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miRNA检测方法

microRNA(miRNA)是一种机体内源性表达的单链小分子RNA,位于基因组非编码区,本身不具有开放阅读框(open readingframe,ORF),具有高度保守性,时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中,不编码任何蛋白质,长度仅为20~24nt。成熟的miRNA5′端有一个磷酸基团,3′端为羟基,由具有发夹状结构的约70~90nt的 …

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将siRNA转染入贴壁动物细胞的转染方案及相关检测

将siRNA转染入贴壁动物细胞(如哺乳动物细胞系、昆虫细胞系)。 以24孔板siRNA转染为例: (1) 转染前一天,接种适当数量的细胞至细胞培养板中,使转染时的细胞密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样,因此,接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验),请使用无抗生素的培养基。 注意:转染时,细胞密度是影响转染效率的关键因素之一,细胞生长过度会削弱细 …

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一个抑制脑中风的miRNA

MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码小RNA,miRNAs能结合到靶基因mRNA的3’非翻译区诱导转录退化和/或抑制翻译。miRNA在多种病理生理过程中发挥着重要的作用。 Let-7c是最丰富且高度保守的miRNA。以往的研究表明,let-7c通过调节细胞增殖和细胞凋亡抑制癌细胞存活率。最近研究表明Let-7c是巨噬细胞极化的重要调节器。 Let- …

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siRNA转染后什么时候做qRT-PCR检测最好?

1.siRNA转染后什么时候做qRT-PCR检测最好? siRNA的沉默效果是有时效性的,在最佳的时间点观察,会得到更加明显的沉默效果,这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定,因为一个是消耗mRNA,一个是产生mRNA。对转染siRNA,在核酸水平,转染后8-48小时,即可观察到mRNA水平的逐步下降,一般来说,转染后48小时进行qRT-PCR …

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RNA的提取方法及原理

RNA提取原理 RNA提取时,加氯仿后分三层:水相(含rna,可能还有少量DNA),中间白色薄层(应该是蛋白和DNA),下层有机相(氯仿和蛋白等) 氯仿是分子量比较大的有机溶剂,在提取RNA时,氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和DNA脱离,DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DN …

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siRNA,shRNA,dsRNA,miRNA间的区别

RNA干扰(RNAi),即用20多个核苷 酸组成的短的双链RNA(siRNA)代替传统反义核酸进行转录后基因沉默,已经迅速而广泛地应用到基因功能,基因表达调控机制研究等热门领域,并为基因 治疗开辟了新的途径。近两年来,这方面的科学论文及报道爆炸性增长,几乎每天都有新的结果涌现。这些论文中,出现了很多与RNA干扰相关的概念,意思很相 近但并不完全相同,这里列举 …

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揭秘RNAi,缔造实验神话

用siRNA进行transient transfection不稳定,几代细胞以后,症状就会消失,所以在转染几天(1-3)后要立刻抽提蛋白,进行分析。 用质粒中的shRNA进行转染,如果质粒含有抗生素位点,可以进行筛选,获得较稳定的细胞株系,但需要时间较长 用病毒中的shRNA进行感染(infection),抗生素筛选后,可以获得很稳定细胞株系。 瞬时RNAi …

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